(1)切片后固定，固定時(shí)間為30s-1min，清水稍沖洗1-2s。

(2)玻片浸沒(méi)于含蘇木素的染缸中，時(shí)間大概為3-5min;然后清水洗去蘇木素，大概5-10s。

(3)再把玻片浸沒(méi)于1%鹽酸乙醇2s;然后清水沖洗1-2s。這個(gè)時(shí)候在顯微鏡下觀(guān)察，細胞核呈紫藍色，細胞漿無(wú)色說(shuō)明操作無(wú)誤。

(4)促藍液(可以是自來(lái)水，或者是1%氨水)返藍5-10s;清水稍沖洗1-2s，顯微鏡下觀(guān)察，細胞核藍色說(shuō)明操作無(wú)誤。

(5)再把玻片浸沒(méi)于含伊紅的染色缸中30-60s，然后清水沖洗干凈表面。顯微鏡下觀(guān)察，細胞核藍色，細胞漿為紅色說(shuō)明操作無(wú)誤。

(6)染色完的片子需要做透明處理來(lái)延長(cháng)保存時(shí)間。利用不同濃度的酒精(從低濃度-高濃度)和二甲苯進(jìn)行該項操作。顯微鏡下觀(guān)察，細胞核藍色，胞質(zhì):肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈現出深淺不一的紅色。

(7)中性樹(shù)膠封片，染色完成。

注意事項:

1.染色時(shí)調節pH值很重要。若組織塊在福爾馬林中固定時(shí)間長(cháng)，組織酸化而影響細胞核著(zhù)色。因此，要在自來(lái)水中沖洗時(shí)間長(cháng)一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細胞核著(zhù)色較深。染伊紅時(shí)胞漿著(zhù)色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

2.切片染蘇木精后，分色是關(guān)鍵，應在顯微鏡下控制進(jìn)行，一般以細胞核染色清楚(晰)而細胞質(zhì)基本無(wú)色為佳。如果過(guò)分延長(cháng)分色時(shí)間將導致染色太淺，應重新染色后再行分色。

3.切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時(shí)可出現白色不透明狀態(tài)，此為脫水不徹底，應將切片退回無(wú)水酒精，更換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。

4.在染色過(guò)程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。

5.切片從二甲苯取出或進(jìn)入二甲苯前，切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。

6.最后封固時(shí)，要用中性樹(shù)脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會(huì )褪色所用樹(shù)脂濃度要適當，樹(shù)脂封固時(shí)不能有氣泡。

7.避免切片污染。出現切片污染，污染物遮蓋該部位的細胞或組織難以觀(guān)察期形態(tài)改變。應定期過(guò)濾各種染液和試劑以避免其中的沉淀物所引起的污染。

8.冬季室溫低時(shí)(14℃C以下)，二甲苯應在水浴缸中適當加溫到30℃C后再脫蠟，以避免因脫蠟不完全引起的染色不均勻呈霧化狀態(tài)。

9.徹底脫水與透明。切片經(jīng)酒精脫水后，過(guò)二甲苯時(shí)若為白色不透明狀態(tài)，為脫水不徹底，應將切片用酒精、二甲苯重新脫水與透明。

10.保持切片的濕潤。在染色過(guò)程中不要讓切片干燥,以免組織收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。

11.封片注意事項。封片時(shí)要用中性樹(shù)脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會(huì )褪色，樹(shù)脂封固時(shí)不能有氣泡。

文章出自：組織冰凍切片染色實(shí)驗    想了解更多請關(guān)注：http://www.shiyi86.com/