一、染色步驟

封閉

用5%空白山羊血清將樣本完全覆蓋，切片需放置于濕盒內，細胞孔板可直接將孔板密封好，置于37℃恒溫恒濕培養箱孵育30min；

一抗稀釋

按照說(shuō)明書(shū)要求，將抗體稀釋于抗體稀釋液中；

一抗孵育

吸走封閉液，加入稀釋后的一抗，4℃孵育過(guò)夜；

復溫

將樣本置于常溫，復溫15min；

洗滌

去除抗體工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；

二抗稀釋

按照說(shuō)明書(shū)要求，將抗體稀釋于抗體稀釋液中；

二抗孵育

避光室溫1h；

洗滌

去除二抗工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；

染核/封片

在樣本上滴加DAPI工作液，避光，室溫，孵育10分鐘；去除DAPI工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；加入抗熒光衰減封片劑后，于熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。

二、7大注意事項及技巧總結

封閉劑選擇和二抗種屬來(lái)源相同的血清，如果是直標一抗選擇和一抗種屬來(lái)源相同；

封閉時(shí)間不易過(guò)長(cháng)，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可；

一抗孵育4℃過(guò)夜比較好，抗原抗體結合會(huì )比較充分；

選擇高質(zhì)量能滿(mǎn)足免疫熒光應用和物種要求的一抗和熒光二抗，一抗二抗的稀釋比例可以根據抗體說(shuō)明書(shū)來(lái)，再結合自己具體的實(shí)驗要求進(jìn)行優(yōu)化；

如果涉及到雙標染色，切記要將兩種蛋白的抗體來(lái)源種屬區分開(kāi)，二抗的熒光素也要區分開(kāi)；

在洗滌過(guò)程中，一要注意動(dòng)作輕柔，固定后的細胞比較脆弱，如果太過(guò)劇烈，很容易把細胞吹洗掉，二是洗滌時(shí)間要把握好，每次洗滌5min左右，三是切忌不要干片，防止背景過(guò)高；

細胞免疫熒光最好不封片，新手很容易在最后一步功虧一簣

文章出自：免疫熒光染色實(shí)驗      想了解更多請關(guān)注：http://www.shiyi86.com/