一、實(shí)驗原理

1、G+細胞壁結構致密(肽聚糖層厚)，且脂質(zhì)少，乙醇不易滲入脫色；G-細胞壁結構疏松，且脂質(zhì)含量多，乙醇易溶解脂質(zhì)滲入脫色；

2、G+菌體含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結晶紫牢固結合，使已著(zhù)色的細菌不易被乙醇脫色；G-含量少，易脫色；

3、G+等電點(diǎn)(pl2~3)比G-等電點(diǎn)(pl4~5)低，在同一pH條件下，G+比G-所帶的負電荷多，故與帶正電荷的堿性染料(結晶紫)結合牢固，不易被乙醇脫色。

二、實(shí)驗材料

菌種管、接種環(huán)、洗瓶、酒精燈、玻片、濾紙、結晶紫、碘液、95％乙醇、稀釋石炭酸復紅染液、顯微鏡、香柏油等。

三、實(shí)驗步驟

1、涂片：

①利用酒精燈外焰依次消毒接種環(huán)的環(huán)（垂直消毒）、金屬絲、部分金屬桿，冷卻片刻；

②左手持生理鹽水試管，右手持接種管（持筆法），取1~2環(huán)生理鹽水至玻片；

③再次消毒接種環(huán)并貼于培養基內側將其冷卻；

④用環(huán)刮取培養基內少許菌體，涂于載玻片上，并將其與生理鹽水充分混合，菌膜1cm2；

⑤再次對接種環(huán)進(jìn)行滅菌處理，并放回原處。

2、干燥：最好在室溫下自然干燥，或標本面朝上，置于離酒精燈火焰約16cm高處緩慢烘干，切不可放在火焰上灼燒。

3、固定：將于燥后的涂片用片夾夾住使標本面向上緩慢通過(guò)火焰三次，自然冷卻。

4、染色：

①初染：滴加1~2 滴結晶紫覆蓋菌膜(1min)，而后水洗(可背面沖洗；水流可控，可以正面一端流水沖洗)；

②媒染：滴加數滴碘液覆蓋表面(1min)，而后水洗；

作用：媒染劑，使結晶紫與細菌結合更牢固。

③脫色：滴加 95%乙醇數滴，輕輕晃動(dòng)玻片，至玻片上流下的酒精液無(wú)紫色為止(0.5~1min)，而后水洗；

④復染：滴加稀釋石碳酸復紅(或沙黃)染液數滴(1min)，而后水洗。

5、干燥：用濾紙干燥。

6、鏡檢：低倍鏡→高倍鏡→油鏡：滴 1~2 滴香柏油于油鏡下觀(guān)察。

四、結果判斷

革蘭陽(yáng)性球菌，呈葡萄串狀排列。

五、注意事項

1、操作因素

涂片太厚或太薄，菌體分散不均勻可影響染色效果；

固定時(shí)避免菌體過(guò)分受熱；

2、細菌因素

菌齡最好18~24小時(shí)，如G+培養時(shí)間過(guò)長(cháng)，或已死亡及部分自行溶解，均呈陰性反應；

3、染液因素

所有染液都應防止蒸發(fā)而影響濃度，特別是碘液久存或受光易失去媒染作用；

脫色酒精95%為宜，若密封不良或涂片積水太多會(huì )影響濃度；

脫色時(shí)間：要根據涂片厚薄而定，不宜過(guò)長(cháng)或過(guò)短；過(guò)長(cháng)G+誤認為G-；過(guò)短G-誤認為G+

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