關(guān)鍵詞：免疫組化染色

（1）烘片：將石蠟切片放入在60 ℃烘箱中烘片至少60分鐘（烘片能提高脫蠟效果，為了省時(shí)省力也可過(guò)夜烘片，但烘片時(shí)間不能過(guò)長(cháng)，否則可能損壞組織）；

（2）脫蠟：將烘好片的石蠟切片完全浸入（至少超過(guò)組織，下面也一樣）二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理：二甲苯Ⅰ 20 分鐘，二甲苯Ⅱ 20 分鐘（二甲苯脫蠟時(shí)間越長(cháng)，脫蠟效果越好，二甲苯脫蠟次數越多，脫蠟效果越好；一般選擇2次二甲苯，每次20分鐘）；

（3）水化：將脫蠟好的石蠟切片依次、完全浸入不同濃度乙醇中進(jìn)行水化處理：100% 乙醇 10 分鐘，100% 乙醇 10 分鐘，95% 乙醇 5 分鐘，90% 乙醇 5 分鐘，85%乙醇 5 分鐘，70% 乙醇 5 分鐘，自來(lái)水或PBS潤洗石蠟切片幾次（乙醇水化時(shí)間也可稍短，至少3分鐘；因乙醇可溶于水，自來(lái)水或PBS潤洗石蠟切片無(wú)時(shí)間要求，我們一般潤洗，就是換水5-10次）；

（4）抗原修復：在高壓鍋（可用帶氣孔的蒸飯鍋）中加入適量枸櫞酸鈉抗原修復液，將潤洗好的石蠟切片沒(méi)入枸櫞酸鈉抗原修復液中（液面沒(méi)過(guò)組織），將高壓鍋放入微波爐中加熱10 分鐘至抗原修復液煮沸，打開(kāi)鍋蓋檢查有無(wú)氣泡（有氣泡表示枸櫞酸鈉抗原修復液已沸騰），蓋好鍋蓋后繼續加熱5 分鐘后打開(kāi)鍋蓋在室溫下自然冷卻，正常約30分鐘；

Tips：a、常用的修復方法有熱修復、微波修復及高壓修復，其抗原修復效果依次增強；b、常用的抗原修復液有枸櫞酸鈉抗原修復液、EDTA修復液，這兩種抗原修復液對絕大多數抗原的修復均有相當良好的修復效果；c、對于相對較難檢測的蛋白比如核蛋白優(yōu)先選擇高壓修復，修復液最好參考抗體說(shuō)明書(shū)；d、抗原修復時(shí)尤其是高壓修復，需注意把握抗原修復時(shí)間（一般根據預實(shí)驗決定修復時(shí)間），時(shí)間過(guò)長(cháng)，容易導致組織脫片；

（5）PBS漂洗修復好的石蠟切片3次，每次5分鐘；

（6）封閉內源性過(guò)氧化氫酶：采用3%的雙氧水完全浸沒(méi)石蠟切片，室溫下避光封閉30分鐘后，PBS漂洗石蠟切片3次，每次5 分鐘；

tips：a、如不進(jìn)行過(guò)氧化氫酶的封閉，容易引起非特異性染色，即背景；b、也有研究者采用3%的雙氧水以滴加的方式封閉內源性過(guò)氧化氫酶；c、封閉時(shí)間至少15分鐘；d、筆者習慣采用浸沒(méi)的方式封閉內源性過(guò)氧化氫酶，并回收、重復使用，最長(cháng)曾使用2月；e、3% 雙氧水可用試劑公司的10%或30%的雙氧水配制，亦可用醫用雙氧水配制；f、有的研究者會(huì )在抗原修復以前進(jìn)行過(guò)氧化氫的封閉，筆者采用抗原修復以后進(jìn)行過(guò)氧化氫封閉，兩者簡(jiǎn)可，個(gè)人認為過(guò)氧化氫酶的活性在抗原修復以后能達到最佳狀態(tài)，因此個(gè)人認為在抗原修復以后進(jìn)行過(guò)氧化氫封閉，效果更佳。

（7）封閉內源性抗原：采用0.1% PBST配制的5% BSA抗原封閉液，室溫封閉60 分鐘（封閉原則同Western-blotting，常用的時(shí)5-10% BSA）；

（8）一抗孵育：滴加0.1% PBS稀釋好的一抗工作液，4 ℃過(guò)夜（抗體孵育結束后可回收抗體，用于Western-Blotting，最好不要重復用于免疫組化），PBS漂洗3次，每次5 分鐘；

（9）二抗孵育：滴加適量HRP標記過(guò)的對應種屬的二抗工作液，室溫孵育60 分鐘；

（10）信號放大：滴加適量生物素底物，室溫反應30 分鐘后PBS漂洗3次，每次5 分鐘；

（11）DAB顯色：按照廠(chǎng)家的試劑使用說(shuō)明配制1×DAB顯色液，滴加至甩干的石蠟組織上，反應一段時(shí)間，顯微鏡下觀(guān)察顯色情況，及時(shí)用自來(lái)水終止染色，并用自來(lái)水潤洗石蠟切片數次；

（12）蘇木精復染：將潤洗過(guò)的石蠟切片沒(méi)入蘇木精染液中10-20s，隨后用自來(lái)水清洗蘇木精染液，（大部分研究者也采用氨水返藍：在氨水中浸潤與提出組織3-4次，和鹽水酒精分化：在鹽酸酒精中浸潤與提出石蠟切片3-4次，需注意氨水及鹽水酒精和時(shí)間，否則容易導致脫色，脫色后亦可DAB再次顯色，上述步驟根據蘇木精的類(lèi)型決定），后采用pH為7.2-7.4的PBS浸泡石蠟切片10分鐘（PBS浸潤時(shí)間可使得細胞核的藍色和目的蛋白的棕色顏色更加鮮艷和靚麗，PBS浸泡時(shí)間越長(cháng)，效果越好）；

（13）組織脫水：按下列步驟進(jìn)行組織脫水， 70% 乙醇5分鐘，85%乙醇5分鐘，90% 乙醇5分鐘，95% 乙醇5分鐘，100% 乙醇10分鐘，100% 乙醇10分鐘（原理與水化類(lèi)似）；

（14）石蠟透明：按以下步驟進(jìn)行組織透明，二甲苯20 分鐘，二甲苯20分鐘；

（15）封片：滴加適量樹(shù)脂封片，注意不要有氣泡（待樹(shù)脂干燥以后，可用二甲苯及無(wú)水乙醇擦洗撥片，去除多余樹(shù)脂，保持撥片干凈）；

（16）掃描石蠟組織切片并進(jìn)行數據分析。