服務(wù)介紹：

Tunel染色即原位末端轉移酶標記技術(shù)。凋亡細胞的DNA雙鏈斷裂或一條鏈出現缺口，產(chǎn)生一系列3’-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)作用下，將脫氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物標記到DNA的3′末端，從而進(jìn)行凋亡細胞的檢測。TUNLE染色是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。

技術(shù)原理：

晚期凋亡細胞中染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的催化下，將帶有生物素(Biotin)分子的dUTP，標記到DNA的3'-末端，隨后和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標記的鏈酶親和素Streptavidin(Streptavidin-HRP)結合，最后通過(guò)DAB顯色來(lái)顯示凋亡細胞，從而可以通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡檢測到凋亡的細胞，這就是Tunel(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法檢測細胞凋亡的原理。

實(shí)驗流程：

 
 
關(guān)鍵實(shí)驗步驟：

1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60oC 20min，再用使用二甲苯兩次5-10min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結合反應充分、均勻；

2.把握好細胞通透的時(shí)間。一般根據切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間，常用10-30min，幾μm切片用短時(shí)間；幾十μm切片用長(cháng)時(shí)間，通過(guò)摸索達到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內。

3.適當延長(cháng)TUNEL反應液的時(shí)間。一般是37oC1h，你也可以根據你的凋亡損傷程度，選擇更長(cháng)的時(shí)間，可長(cháng)至2h，但要結合你最終的背景著(zhù)色。

4.DAB顯色條件的選擇。一般DAB反應10min左右，結合鏡下控制背景顏色，最長(cháng)不超過(guò)30min；promega公司提供的DAB液（桃紅色），不利于辨認棕褐色，我不太喜歡。

5.PBS的充分清洗。在TUNEL反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格，可增加次數達5次，因為這些清洗直接決定最后切片的非特異性著(zhù)色。

6.內源性POD的封閉也十分關(guān)鍵。對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，我的經(jīng)驗是適當延長(cháng)封閉時(shí)間和升高過(guò)氧化氫的濃度，可以達到很好的封閉效果，且不影響最終的特異性染色。

實(shí)驗結果展示：

注意事項：

1、洗滌蛋白酶K時(shí)，一定要PBS沖洗3次，如果沖洗不凈會(huì )嚴重干擾后續的標記反應；

2、3%的過(guò)氧化氫溶液孵育時(shí)間不應過(guò)長(cháng)，否則會(huì )出現過(guò)氧化氫導致的DNA斷裂，產(chǎn)生假陽(yáng)性

3、滴加Tunel檢測液時(shí)，可利用防蒸發(fā)膜防止其蒸發(fā)影響樣本的生物素標記；配制好的DAB顯色液必須一次性使用完畢，不宜凍存。

常見(jiàn)問(wèn)題：

無(wú)/弱染色？

烤片溫度過(guò)高，推薦56℃-60℃1-2h；

一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過(guò)低，孵育是否時(shí)間過(guò)短等。

染色過(guò)深？

染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)；

顯色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)。

送樣運輸要求：

1、石蠟切片常溫、組織由標準的石蠟包埋盒包埋，石蠟與組織要均勻接合，不能有裂痕；蠟塊厚度根據所需切片的數量而定，有效厚度至少要超過(guò)0.1cm。盡量提供半年內的組織蠟塊，超過(guò)半年的蠟塊抗原可能丟失，做免疫組化可能出現檢測不到蛋白。

2、冰凍切片-20℃、固定后細胞爬片4℃。